涂料中的納米顆粒與原生納米顆粒在小鼠體內(nèi)的毒性

納米材料*的物理和化學(xué)性質(zhì)使得它在越來越多的工業(yè)應(yīng)用中被使用，漆料添加劑中也廣泛使用了納米材料。例如，二氧化鈦（TiO₂）工程納米顆粒（ENP）具有良好的抗UV，自清潔和空氣凈化效果。銀（Ag）ENPs以其抗微生物能力而聞名，二氧化硅（SiO₂）ENP用作阻燃劑和抗刮涂層。本研究比較了三種原始ENPs（TiO₂，Ag和SiO₂），實(shí)驗(yàn)將含有ENPs（TiO₂，Ag和SiO₂）的三種老化涂料與不含ENPs的對照涂料的毒性效應(yīng)和生物分布進(jìn)行對比。用ENP或油漆顆粒（20μg/吸出）讓BALB / c小鼠口咽吸入，每周一次，持續(xù)5周，并在zui后抽吸治療后2或28天令其死亡。進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，評(píng)估全身血液毒性，并完成炎癥細(xì)胞誘導(dǎo)因子和關(guān)鍵的血液參數(shù)的細(xì)胞計(jì)數(shù)。此外，提取出肺，肝，腎，脾和心臟并測定金屬濃度。

原始ENPs在肺中引起的影響較小，在血液中引起的改變也可以忽略不計(jì)。在吸入含有Ag ENPs的氣體后觀察到的毒性作用zui顯著；測定了嗜中性粒細(xì)胞和促炎細(xì)胞因子分泌物（角化細(xì)胞化學(xué)引誘物（KC）和白細(xì)胞介素-1β（IL-1β））的量增加了兩倍以上。含有TiO₂ ENP的涂料不改變巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，但輕度誘導(dǎo)KC和IL-1β。含有Ag或SiO₂的涂料沒有顯示顯著的毒性。生物分布實(shí)驗(yàn)顯示吸入Ag或SiO₂ ENPs后，Ag和Si在肺外的分布?？偺醽碇v，該研究證明即使直接暴露于ENPs環(huán)境下能夠誘導(dǎo)出一些毒性作用，但當(dāng)他們被嵌入一個(gè)復(fù)雜的油漆基質(zhì)后，期不良的毒理作用被大幅度降低甚至微乎其微。

工程納米粒子（ENPs）的當(dāng)前應(yīng)用覆蓋廣泛的工業(yè)和消費(fèi)部門，包括化妝品，藥??物和材料科學(xué)。在結(jié)構(gòu)領(lǐng)域，ENP可以改善重要的材料特性，例如提高強(qiáng)度和耐久性，同時(shí)降低總重量。 ENP還顯示出對材料添加有用的性質(zhì)，包括熱，自清潔和防霧效果。 ENPs在木材，金屬，陶瓷，天然石材，混凝土，復(fù)合材料和塑料的新涂料和涂料體系的開發(fā)中也顯示了作為涂料添加劑的巨大潛力。在工業(yè)應(yīng)用方面，涂料，涂料和顏料是ENPs在總體使用方面的zui重要的應(yīng)用。

在油漆和涂料中使用的三種zui普遍的ENP是二氧化鈦（TiO₂），銀（Ag）和二氧化硅（SiO₂）。 2008年Mueller和Nowack的一項(xiàng)研究表明，在歐洲，35％的納米Ag生產(chǎn)和25％的納米TiO₂生產(chǎn)被涂料和涂料行業(yè)使用，使該行業(yè)成為納米Ag的*個(gè)終端用戶，納米TiO₂的第二終端用戶。納米TiO₂的光催化和疏水性質(zhì)產(chǎn)生具有自清潔，空氣凈化和抗UV性能的涂層。納米Ag替代化學(xué)殺菌劑的抗菌效率，而添加納米二氧化硅將增加涂料和涂料的耐劃傷性和耐火性。目前在油漆和涂料中使用的其它ENP主要來源于具有自清潔和抗UV性能的氧化鋅（ZnO），以及以耐火性和高拉伸強(qiáng)度見長的碳納米管。

油漆和涂料中使用的ENP接觸可能在生產(chǎn)過程中或當(dāng)涂覆涂層時(shí)發(fā)生。氣體吸入是zui可能的接觸途徑，特別是當(dāng)涂料通過噴涂應(yīng)用通常在涂料工業(yè)中進(jìn)行時(shí)。同時(shí)，材料的老化過程例如長時(shí)間暴露在UV環(huán)境中，熱應(yīng)力作用，水損壞和劃痕或在砂磨、鉆孔過程中暴露在空氣中。此外，在空間狹小缺乏通風(fēng)的室內(nèi)，毒性物質(zhì)的含量要比室外環(huán)境更高。

ENPs的毒性是過去幾年的主要研究焦點(diǎn)。但當(dāng)它們嵌入復(fù)雜的涂料或涂料基質(zhì)中后，人們對它們的毒性了解卻并不多。在本研究中，比較了三種原始ENPs（TiO2，Ag和SiO2），含有ENPs（TiO2，Ag和SiO2）的三種老化涂料與不含ENPs的對照涂料的炎癥和毒性作用。通過口咽吸入使小鼠肺部與有毒物質(zhì)接觸。此外，通過電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）評(píng)估原始ENP和包含ENP的老化涂料對不同器官（肺，腎，脾，肝和心臟）造成的影響。我們的研究結(jié)果表明，雖然接觸原始ENPs確實(shí)能夠誘發(fā)毒性反應(yīng)，但在油漆基質(zhì)阻止了大多數(shù)顆粒的毒性傳遞。

材料和方法

材料

含有（TiO₂，Ag和SiO₂）ENPs的涂料和沒有ENPs的對照涂料由工業(yè)項(xiàng)目合作伙伴提供。

異氟烷（Forene）獲自Abbott Laboratories（SA Abbott NV，Ottignies，Belgium）。

戊巴比妥（Nembutal），來自SanofiSantéAnimale （CEVA，Brussels，Belgium）。

制造老化的粉末涂料顆粒

使用涂膜器將液體涂料施加在塑料板上，產(chǎn)生200μm厚的均勻膜。在室溫（20℃）下干燥24小時(shí)后，使用金屬刮刀手動(dòng)除去油漆以獲得粉末涂料。這些粉末使用行星式球磨機(jī)研磨，zui后暴露于UV-A（Philips TL20W / 09N）500小時(shí)（64個(gè)亮度循環(huán)，光暗時(shí)間4h-4h ）式材料老化。

粒子表征

掃描電子顯微鏡

將老化的涂料粉末沉積在用自粘碳標(biāo)簽（G3347N，Agar Scientific，Essex，UK）覆蓋的鋁柱上。在金濺射之后，通過掃描電子顯微鏡（SEM）（Jeol JSM-6610 LV，加速電壓：10kV，工作距離：10mm）表征涂料顆粒。

動(dòng)態(tài)光散射

在ALV / CGS 3儀器（ALV，Langen，德國）上進(jìn)行多角動(dòng)態(tài)光散射（DLS）測量。為了避免任何可能的污染，用過濾的丙酮（450nm Chromafil PTFE過濾器）清潔毛細(xì)管，并在測量前在110℃下干燥。將樣品置于超聲浴中15分鐘，并在測量前插入5分鐘以允許溫度穩(wěn)定。在30°至150°的散射角度下以15°的步長執(zhí)行幾組60s的DLS測量，波長為632.8nm。這種多角度方法將允許校正由顆粒各向異性和/或多分散性導(dǎo)致的散射強(qiáng)度的角度依賴性。強(qiáng)度自相關(guān)函數(shù)的建模使用累積方法（如果適用）和用zui大熵方法進(jìn)行交叉檢查。

ζ電位

ζ電位測量在ZetaPlus zeta電位分析儀上進(jìn)行，用ZetaPALS選項(xiàng)擴(kuò)展。 PALS（相位分析光散射）比基本ZetaPlus設(shè)置中使用的Doppler方法更靈敏。在DLS測量之后回收ζ電勢測量的樣品，并使用Smoluchowski模型分析獲得的結(jié)果。

老鼠

雄性BALB / c OlaHsd小鼠（6周齡）。將小鼠飼養(yǎng)在具有12-h暗/光循環(huán)的常規(guī)動(dòng)物房中。將它們?nèi)菁{在過濾器頂籠中并且隨意接受輕微酸化的水和顆粒狀食物。所有實(shí)驗(yàn)程序由當(dāng)?shù)貏?dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

實(shí)驗(yàn)方案

在第0,7,14,21和28天，在光異氟烷麻醉下接受原始ENP的口咽吸入（25μl），含有ENP的老化的涂料顆粒，控制老化的涂料顆粒（0.8mg / ml）或賦形劑鹽水（0.9％NaCl））。在zui終抽吸治療（第30天）后2天通過腹膜內(nèi)注射戊巴比妥（90mg / kg體重）處死小鼠。暴露于原始ENP或載體的第二組小鼠在zui終抽吸治療（第56天）后28天處死。實(shí)驗(yàn)方案的示意圖如圖1所示。

圖1：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖。

 在第0,7,14,21和28天通過在異氟醚麻醉下口咽吸入將小鼠暴露于不同的顆粒。

在第30或56天進(jìn)行尸體解剖。

肺部炎癥（支氣管肺泡灌洗）

在用0.4ml無菌鹽水（0.9％NaCl）原位灌注右肺之前夾住左肺支氣管三次，收集回收的液體。使用Bürker血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)總細(xì)胞，并將支氣管肺泡灌洗（BAL）流體離心（1000g，10分鐘）。通過分光光度監(jiān)測丙酮酸鹽的還原在上清液中測定乳酸脫氫酶，將剩余的上清液冷凍（-80℃）直至進(jìn)一步分析。對于白細(xì)胞亞群的細(xì)胞計(jì)數(shù)，將250μl重懸浮的顆粒（100,000細(xì)胞/ ml）旋轉(zhuǎn)（300g，6分鐘）到顯微鏡載玻片上，空氣干燥。對于每個(gè)樣品，對200個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的數(shù)目。在冷凍上清液解凍后，使用Bio-Rad蛋白質(zhì)測定，根據(jù)Bradford方法測定總蛋白質(zhì)水平。

細(xì)胞因子

取出兩片左肺葉，在液氮中快速冷凍并儲(chǔ)存在-80℃直至進(jìn)一步分析。在均質(zhì)化的肺組織中用小鼠炎癥因子7測量炎性細(xì)胞因子（白介素-1β（IL-1β），IL-12p70，IFN-γ，IL-6，角質(zhì)形成細(xì)胞化學(xué)引誘物（KC），IL-10和TNF- -Plex Ultra-Sensitive Kit。

金屬濃度

通過ICP-MS在另一肺片，腎，脾，肝和心臟中測量Ti，Ag和Si濃度。將1毫升硝酸（HNO 3）60％ultrapur加入?30mg組織或3-4mg涂料顆粒中，并在140℃下加熱5小時(shí)。zui后，將樣品在Milli-Q水中稀釋至10ml，并通過ICP-MS（Agilent 7700x ICP-MS）測量Ti，Ag和Si濃度。使用Ge和Rh作為內(nèi)標(biāo)，測量元素為47Ti，107Ag和28Si。溶液中的定量限為0.15μg/ l（Ag和Ti）或15μg/ l（Si）。

系統(tǒng)性炎癥（血液參數(shù)）

從眶后叢收集血液。在Cell-Dyn 3500R計(jì)數(shù)器（Abbott，Diegem，Belgium）上進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)和差異。將全血離心（14,000g，10分鐘）后獲得的血漿樣品儲(chǔ)存在-80℃直至進(jìn)一步分析。使用Mouse ProInflammatory 7-Plex Ultra-Sensitive Kit在血漿中測量炎性細(xì)胞因子（IL-1β，IL-12p70，IFN-γ，IL-6，KC，IL-10和TNF- Gaithersburg）。

數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)表示為平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）。使用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，隨后通過Dunn多重比較檢驗(yàn)（分析所有數(shù)據(jù)。 p <0.05的水平被認(rèn)為是顯著的。